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关于大肠菌群平板计数法的一些实践经验分享!

一、VRBA培养相关问题
1.所用器皿是否需要灭菌?
答:不需要。配制培养基所用到的锥形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要灭菌,但要求一定要清洗干净,表面无污渍、无残留。煮沸完成后,取下锥形瓶,用一般常用的卫生纸(软纸)覆盖瓶口,用橡皮筋缠绕,待冷却至适宜温度即可倾注培养基。在倾注培养基时,须点燃酒精灯,稍微灼烧锥形瓶口。

2.如何保持“煮沸2min”?
答:可以用电磁炉或电热板进行加热煮沸,在该培养基即将煮沸时调低温度。实际操作时,不需要严格按照此要求进行,加热煮沸数秒即可。原因:本培养基很难保持煮沸2min,一旦煮沸,则培养基很快上涌、翻腾,若不调低温度或立刻采取其他措施,则培养基可在数秒内喷涌出来,严重者可喷涌2米以上、电磁炉周围1—2米范围内都是培养基飞溅的范围(实验室危险因子之一)。


3.若培养基未用完,是否可以冷藏起来下次用?
答:不可以。4789.28中已规定,固体培养基最多允许熔融1次(指的是经过高压灭菌冷却后的培养基还可以熔融一次后使用)。且VRBA培养基冷却后,再次熔融时非常容易喷涌,若温度控制不当,底部培养基熔融后很快就会发生喷涌(即培养基未完全熔融就会发生喷涌现象)


4.倾注完成后是否需要“覆盖一层”?如何覆盖?
答:一般情况下不需要覆盖。在实际操作过程中,若检验员初次接触该食品(或食品品类),则有必要在倾注培养基后再覆盖一层(原因是不清楚该样品是否会发生蔓延)。而如此往复测试几次后,若该样品或食品品类均不存在蔓延现象,则以后的实验中都不需要进行覆盖。若重复多次测试后都有蔓延现象,则以后的检验中最好都进行覆盖,最好是在原培养基已凝固或半凝固(不会发生晃动)时再倾注一层培养基(“一层”是指缓慢倾注培养基至培养基刚好能够覆盖整个平皿)。



二、如何确定培养基上长的是不是大肠菌群?
答:不要去管什么是大肠菌群的典型形态,建议新手们认真按照标准进行证实试验,此证实试验非常简单,每一次VRBA上有菌落生长都进行证实试验,如此往复3-4次,对于哪种形态才是大肠菌群已经能够了然于心了。建议平时多配一些BGLB肉汤管冷藏储存备用,需要进行证实试验时分分钟可以完成试验(BGLB肉汤管一般可储存2-3个月,建议配制10-20管左右,不要配制太多,证实试验很少做)。



三、两个梯度都长了菌,如何选取?

答:选取15-150CFU之间的平板(指的是VRBA平板上所有菌落数在此范围),挑取可疑菌落进行证实试验。详细举例说明:若有两个连续梯度的4个平板上菌落数均在15-150之间,则4个平板上的菌落都要挑取进行证实试验,实际操作时,可灵活操作,如:1:10的两个平板上的菌落数分别为120、123,1:100的两个平板的菌落数分别为16、18,严格来讲必须至少在每个平板上分别挑取5个可疑菌落、5个典型菌落进行证实试验,如此需要40根BGLB肉汤管。建议使用镍合金接种环(即传统的接种环,而不是一次性塑料接种环),因为VRBA上生长的菌落(无论典型或可疑)大部分长在底层、且菌落一般较大,被培养基覆盖,传统的接种环较细,用以刮去上层培养基较方便,挑取菌落也较方便。


四、如何进行证实试验?菌落选取数量?
答:同上所述,建议新手们VRBA上的所有不同形态的菌落都进行证实试验。每种不同形态都挑取5个进行证实试验(若BGLB管足够,建议多挑取几个进行试验)。
注意:A.每种可疑菌落挑取5个,每个菌落放入1管GBLB管中;B.“产气者,记为大肠菌群阳性管”,就要求在实验前须认真筛选BGLB管,凡产气的GBLB管应弃去不用。



五、结果如何计算?
答:首先,在VRBA培养24h后进行计数,分别计数可疑大肠菌群和典型大肠菌群(何为可疑、何为典型?同“2”,检验员多进行几次实验后自然很清楚典型的大肠菌群是何种形态)的数量。假如在1:10的平板上可疑大肠菌群有10个,典型大肠菌群有6个;证实实验应该按照可疑跟典型5:3的比例进行挑选。

例:10-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100*6/10*104/g(mL)=6.0*105 CFU/g(mL)。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。



六、若平板上很多菌落,最终证实全部为阴性,结果如何计算?
答:首先是证明提问者没有认真看标准。 “很多”是多少?是否在15—150范围内?是哪一个稀释度?根据第3条,选取适宜菌落数的平板挑取菌落进行证实试验,若证实全部为阴性,则需要再挑取更低稀释度的平板上的菌落(建议可疑和典型菌落分别挑取10个)进行证实试验,若第二次证实试验均呈阴性,以<1乘以最低稀释度进行计算,如:1:10的平板菌落数分别为120、123,1:100的平板上菌落数分别为16、18,首先挑取1:100的两个平板上的菌落进行证实试验,若全部为阴性,再挑取1:10的两个平板上的菌落进行证实试验,若1:10的平板上的菌落数证实为阴性,则最终计算过程为<1x10,最终结果为<10;若1:10的的平板上的菌落有阳性管,则按照第5条进行计算。

 
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